REPLIKASI DNA

Posted by Nursaptia Purwa Asmara on Sunday, June 09, 2013 with 10 comments

Definisi Replikasi

Bahan genetik yang ada pada setiap jasad akan mengalami proses perbanyakan sebagai salah satu tahapan sangat penting dalam proses pertumbuhan sel atau perbanyakan partikel virus. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagai proses replikasi. Replikasi bahan genetik dapat dikatakan sebagai proses yang mengawali pertumbuhan sel, meskipun sebenarnya pertumbuhan merupakan suatu resultan banyak proses yang saling berkaitan satu sama lain. Sel mempunyai mekanisme replikasi bahan genetik yang dilengkapi dengan system penyutingan (editing) yang sangat akurat sehingga bahan genetik yang diturunkan kepada sel anakan (progeny) mempunyai komposisi yang sangat identik dengan komposisi bahan genetik sel induk. Replikasi bahan genetik diikuti oleh pembentukan sel-sel anakan yang membawa duplikat bahan genetik hasil replikasi. Sehingga kesalahan dalam proses replikasi bahan genetik dapat mengakibatkan perubahan pada sifasifat sel anakan.

Mekanisme replikasi bahan genetik sangat kompleks dan melibatkan banyak protein yang masing-masing mempunyai peranan spesifik. Protein-protein yang terlibat di dalam proses replikasi bahan genetik dikode oleh gen-gen yang terdapat di dalam bahan genetik itu sendiri. Oleh karena itu, ada kaitan fungsional yang sangat erat dan tidak terpisahkan antara proses replikasi bahan genetik dengan proses ekspresi genetik dan metabolisme sel secara keseluruhan. Hambatan yang terjadi pada proses metabolisme, misalnya penghambatan produksi energy, dapat pula mempengaruhi proses replikasi karena replikasi juga memerlukan pasokan energy.


Hipotesis Mekanisme Replikasi DNA

Sebelum mekanisme replikasi DNA dapat dibuktikan secara eksperimental oleh Matthew dan Franklin Sthal pada tahun 1958, ada tiga hipotesis yang berkembang mengenai mekanisme replikasi DNA, antara lain model replikasi secara:
  1. Semikonservatif yang dikemukakan oleh Watson dan Crick, dimana setiap molekul untaian ganda DNA anakan terdiri atas satu untaian-tunggal DNA induk dan satu untaian-tunggal DNA hasil sintesis baru.
  2. Konservatif. Molekul DNA untaian-ganda induk tetap bergabung sedangkan kedua untaian DNA anakan terdiri atas molekul hasil sintesis baru.
  3. Dispersif, menyatakan bahwa molekul DNA induk mengalami fragmentasi sehingga DNA anakan terdiri atas campuran molekul lama (berasal dari DNA induk) dan molekul hasil sintesis baru.
Gambar macam-macam hipotesis mekanisme replikasi DNA

Pembuktian Replikasi Semikomservatif oleh Mattew Meselson dan Franklin Stahl

Hipotesa tentang replikasi semikonservatif diusulkan oleh Watson dan Crick setelah publikasi paper mereka tentang stuktur DNA; teori tersebut dibuktikan percobaan yang didesign oleh Mattew Meselson dan Franklin Stahl pada tahun 1958. Meselson dan Stahl menumbuhkan sel Escherichia coli selama beberapa generasi pada medium dimana sumber nitrogen (NH4Cl) mengandung 15N, isotop nitrogen terberat disamping isotop normal, yakni 14N. DNA yang terisolasi dari sel ini memiliki densitas 1% lebih besar dari pada DNA normal DNA[14N]. Meskipun perbedaannya kecil, campuran [15N]DNA berat dengan [14N]DNA ringan dapat dipisahkan dengan sentrifugasi untuk keseimbangan pada garadien densitas klorida sesium.

Sel E.coli yang berkembang pada medium 15N ditransfer ke medium baru yang hanya mengandung isotop 14N, dimana sel-sel tersebut dibiarkan berkembang sampai populasi sel menjadi berlipat ganda. DNA yang terisolasi dari generasi pertama sel membentuk pita tunggal pada gradient CsCl pada posisi yang mengindikasikan bahwa DNA helik ganda dari sel turunan merupakan hibrida yang mengandung satu strand 14N baru dan satu stran 15N inang.

Hasil ini menumbangkan replikasi konservatif, hipotesis lain dimana satu turunan molekul DNA akan terdiri dari dua strand DNA hasil sintesa baru dan yang lainnya akan mengandung dua strand inang, sementara tidak akan dihasilakan molekul DNA hybrid pada percobaan Meselson-Stahl. Hipotesis replikasi semikonservatif kemudian mendukung langkah selanjutnya pada percobaan. Pada medium 14N, sel dibiarkan mengganda, dan produk hasil DNA dari lingkaran kedua replikasi ini menunjukan dua pita, satu memiliki densitas yang sama dengan DNA ringan dan yang lainnya memiliki densitas DNA hybrid yang diamati sel pertama menggandakan diri. Hasil eksperimen seperti gambar dibawah ini:
Meskipun demikian, bukti-bukti baru menunjukkan adanya penyimpangan dari teori replikasi semacam ini. Diketahui bahwa mekanisme replikasi DNA pada virus tertentu, misalnya virus ϕX174, yang genomnya berupa DNA untaian-tunggal, melibatkan tahapan proses replikasi DNA dengan mekanisme yang berbeda yaitu dengan model konservatif, meskipun hanya pada tahapan tertentu.

Mekanisme Replikasi DNA Semi-Konservatif

Tahapan mekanisme replikasi DNA semikonservatif secara garis besar adalah:
  1. pemisahan (denaturation, denaturasi) untaian DNA induk,
  2. peng-“awal”-an (initiation, inisiasi) sintesis DNA,
  3. pemanjangan (elongation, elongasi) untaian DNA,
  4. ligasi (ligation) fragmen-fragmen DNA, dan
  5. peng-“akhir”-an (termination, terminasi) sintesis DNA.
Gambar mekanisme replikasi DNA semikonservatif

Penjelasan tahapan replikasi DNA semikonservatif secara SINGKAT

keterangan: (1) Lagging strand; (2) Leading strand; (3) DNA polimerase; (4) Enzim DNA ligase; (5) Primer; (6) Primase; (7) Fragmen Okazaki (8) Molekul DNA polymerase; 
(9) Enzim helikase; (10) Protein pengikat untaian tunggal; (11) Topoisomerase

  1. Heliks ganda DNA (merah) dibuka menjadi dua untai tunggal oleh enzim helikase (9) dengan bantuan topoisomerase (11) yang mengurangi tegangan untai DNA.
  2. Untaian DNA tunggal dilekati oleh protein-protein pengikat untaian tunggal (10) untuk mencegahnya membentuk heliks ganda kembali.
  3. Primase (6) membentuk oligonukleotida RNA yang disebut primer (5)
  4. Molekul DNA polimerase (3) & (8) melekat pada seuntai tunggal DNA dan bergerak sepanjang untai tersebut memperpanjang primer, membentuk untaian tunggal DNA baru yang disebut leading strand (2) dan lagging strand (1).
  5. DNA polimerase yang membentuk lagging strand mensintesis segmen-segmen polinukleotida diskontinu (disebut fragmen Okazaki (7)).
  6. Enzim DNA ligase (4) kemudian menyambungkan potongan-potongan lagging strand.

Penjelasan tahapan replikasi DNA semikonservatif secara RINCI


1. Inisiasi, DNA dalam sel-sel eukaryotik memiliki ARCs (autonomously replicating sequence) yang berperan sebagai asal muasal replikasi dan mereka saling berlawanan dari asal bakterial (ORI). ARCs terdiri atas 11 pasangan landasan rentetan tambah dua atau tiga rentetan nucleotida pendek tambahan dengan 100 hingga 200 pasangan landasan sepanjang area DNA. Grup utama dari enam protein, secara kolektif  dikenal dikenal sebagai ORC (Origin Recognition Complex), mengikat asal muasal replikasi, menandai replikasi DNA dengan tepat pada saat waktu yang sesuai melalui siklus sel. Pengenalan situs awal replikasi, oleh suatu protein komponen polymerase DnaA yang dihasilkan oleh gen dnaA.



2. Terbentuknya Garpu Replikasi. Garpu replikasi atau cabang replikasi (replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi “cetakan” untuk pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotida komplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan memperpanjang oligonukleotida (RNA) yang dibentuk oleh enzim primase dan disebut primer.



3. Pemanjangan Untaian DNA. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan menambahkan nukleotida dalam hal ini, deoksiribonukleotida ke ujung 3′ hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan kata lain, rantai DNA baru (DNA “anak”) disintesis dari arah 5′→3′, sedangkan DNA polimerase bergerak pada DNA “induk” dengan arah 3′→5′. Namun demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi 3′→5′, sementara untaian lainnya berorientasi 5′→3′, dan helikase bergerak membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5′→3′. Oleh karena itu, replikasi harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut.



4. Pembentukan Leading strand. Pada replikasi DNA, untaian pengawal (leading strand) ialah untaian DNA disintesis dengan arah 5′→3′ secara berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk DNA menggunakan ujung 3′-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis DNA berlangsung secara berkesinambungan,  searah dengan arah pergerakan garpu replikasi.



5. Pembentukan Lagging strand. Lagging strand ialah untaian DNA yang terletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen Okazaki. Panjang fragmen okazaki mencapai sekitar 2.000 nukleotides panjang dalam sel-sel bakterial dan sekitar  200 panjang nukelotides dalam sel-sel eukaryotic. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3′ bebas pada primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5′→3′. Fragmen primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap.



DNA polymerases tidak mampu ‘mengisi’ ikatan covalent yang hilang. Celah yang tersisa direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan ikatan phosphodiester antara 3’ – OH dari salah satu helaian dari 5’-P dari helaian yang lain.DNA ligase diaktifkan oleh AMP (adenosine monophosphate) sebagai ‘cofactor’ (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP dibawa dari nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligase-ligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan pemasang enzim-enzim untuk perekatan ‘celah’ melalui molekul DNA.



6. Modifikasi Post-Replikasi DNA, Setelah DNA direplikasikan, dua helaian tersintesis terbaru dipasangkan ke modifikasi enzimatik. Perubahan-perubahan ini biasanya melibatkan penambahan molekul-molekul tertentu untuk mengkhususkan titik-titik sepanjang helix ganda. Pada cara ini, tags sel, atau label-label, DNA, sehingga ini bisa membedakan material genetiknya sendiri dari berbagai DNA asing yang mungkin bisa masuk ke dalam sel. Modifikasi post-replikasi DNA mungkin juga mempengaruhi cara molekul diikat. DNA merupakan faktor utama modifikasi dengan penambahan kelompok methyl ke beberapa adenine dan residu-residu cytosine. Grup methyl ditambahkan oleh DNA methylasess setelah nucleotides telah digabungkan dengan DNA polymerases.


Penambahan methyl ke cytosine membentuk 5-methylcytosine dan methylasi dari adenine membentuk 6-methyladine. Methyladine lebih umum daripada methylcytosine dalam sel-sel bakterial, di mana dalam sel-sel eukaryotik, grup methyl paling banyak ditambahkan ke cytosine. Methylase muncul hanya pada beberapa rentetan nucleotide khusus. Dalam sel-sel eukaryotik, sebagai contoh, methylasi secara umum muncul pada saat cytosine berdampingan ke guanine di sisi 3’-OH (5’ P-CG-3’OH).Pola methylasi bersifat spesifik untuk spesies yang diberikan, berperan seperti tanda tangan untuk DNA spesies tersebut. Hal ini patut diperhatikan karena grup methy melindungi DNA melawan perlawanan enzim-enzim tertentu disebut ‘restriction endonucleases’ Oleh karena itu DNA asing melalui  sebuah sel dicerna dengan ‘restriction endonucleases’. Dalam sel tertentu, ‘restriction endonucleases’ bisa memotong DNA di titik khusus tertentu di mana DNA methylase menambah sebuah grup methyl.


Pola methylasi melindungi DNA dari cernaan oleh sel yang memiliki endonucleases tapi tidak melawan pembatasan enzim-enzim yang diproduksi sel-sel spesies yang lain. Pembatasan ini menyederhanakan pertukaran DNA antar sel dari spesies yang diproduksi sel-sel spesies yang berbeda. Methylasi DNA pada titik-titik tertentu mungkin akan berakhir pada konversi terdekat dari B-DNA ke bentuk-bentuk Z-DNA. Dalam bentuk B-DNA, grup-grup hydropholic methyl dari alur utama, menghasilkan pengaturan yang tepat. Dengan mengubahnya ke bentuk Z, grup-grup methyl membentuk area hydropholik yang membantu menstabilkan DNA. Konversi lokal ini (dari B-DNA ke Z-DNA) mungkin mempengaruhi fungsi beberapa gen.

Enzim-enzim yang berperan dalam proses replikasi DNA



No.
Nama Enzim
Keterangan Fungsi
1
Helikase (DnaB)
memutuskan ikatan-ikatan hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA sehingga terbentuk garpu/cabang replikasi
2
Topoisomerase
mengurangi ketegangan superheliks DNA dengan menciptakan istirahat sementara pada satu atau kedua untai DNA
3
Primase
mensintesis RNA-primer
menghentikan perkembangan garpu/cabang replikasi untuk mencegah leading strand melampaui lagging strand
mengawali pembentukan DNA baru pada leading strand atau DNA fragmen Okazaki pada lagging strand oleh DNA Polimerase
4
DNA polimerase
enzim utama yang mengkatalisi proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA
menambahkan nukleotida bebas hanya pada ujung 3' dari rantai yang baru terbentuk, sehingga terjadinya elongasi (pemanjangan) pada rantai baru dengan arah dari ujung 5' ke ujung 3'
menggunakan gugus OH 3' bebas pada RNA-primer untuk mensintesis DNA dengan arah 5'→3'
hanya bisa menambahkan nukleotida ke ujung 3' yang sudah ada, karena itu butuh primer sehingga nukleotida dapat ditambahkan
5
DNA ligase
menggabung fragmen-fragmen okazaki (lagging strand) saat proses replikasi
menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis
Categories: